植物組織培養(yǎng)具有培養(yǎng)周期短，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，是種質(zhì)資源保存、育種以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究的有效技術(shù)手段，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林業(yè)等領(lǐng)域。影響植物組織培養(yǎng)成敗的主要因子有樹種、品種、外植體、培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。

  樹莓為薔薇科懸鉤子屬樹種，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病和增強(qiáng)免疫力等作用，有較大的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。樹莓優(yōu)良品種被引入我國(guó)已有30多年的歷史，栽培面積較大，目前還是以根孽苗繁殖、栽培為主，導(dǎo)致品種退化、產(chǎn)量降低，病蟲害問(wèn)題嚴(yán)重，國(guó)外樹莓品種栽植上主要采用組培苗，甚至很多國(guó)家都采用脫毒苗?！安ɡ{”是夏、秋雙季結(jié)果型紅樹莓品種，果實(shí)較大，口味佳，耐寒，因每芽產(chǎn)生兩個(gè)結(jié)果側(cè)枝而高產(chǎn)，在黑龍江省7月下旬開始采收秋果，適合秋季早霜期較早的地區(qū)種植。因此，本研究采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)“波拉納”進(jìn)行繁殖研究，以期建立其離體培養(yǎng)再生組培體系，為今后工廠化育苗和種質(zhì)資源保存等工作奠定基礎(chǔ)。

  1 材料與方法

  1.1 試驗(yàn)材料

  試驗(yàn)材料為葦河林業(yè)局青山種子園采摘園內(nèi)露地栽培的“波拉納”2年根蘗苗。

  1.2 試驗(yàn)方法

  1.2.1 外植體消毒及基本培養(yǎng)基的篩選

  取當(dāng)年新生嫩枝剪成段，放入組培瓶中，滴2～3滴洗潔精，在自來(lái)水下沖洗1 h左右。在超凈工作臺(tái)上，用75%的乙醇溶液消毒，消毒時(shí)間設(shè)定為0、30、50 s，無(wú)菌水沖洗1次，轉(zhuǎn)到0.1%的升汞中滅菌，滅菌時(shí)間設(shè)定為2、4、8 min，再以2%次氯酸鈉滅菌，滅菌時(shí)間設(shè)定為2、4、8 min，無(wú)菌水沖洗4次，很后用無(wú)菌濾紙吸干表面水份，以WPM、1/2 MS、MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5 mg/L6BA和0.1 mg/LNAA，將消毒后的帶腋芽莖段剪成1～2 cm接種到培養(yǎng)基上，按照正交表L9(34)設(shè)計(jì)成 9 種不同的處理，每個(gè)處理接種40個(gè)莖段，重復(fù) 3 次。蔗糖 25 g/L，瓊脂 6.0 g/L，pH 值 5.8，培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光周期14 h/d，光照強(qiáng)度2 200 lx，以下試驗(yàn)條件均與此相同。接種一周后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率，接種后20 d調(diào)查成活率。

  1.2.2 增殖培養(yǎng)

  以MS為基本培養(yǎng)基，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑KT、NAA和6 BA，KT濃度設(shè)定為0、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度設(shè)定為0.1、0.2、0.5 mg/L，6 BA濃度設(shè)定為0.1、0.5、1.0 mg/L。按照正交表 L9( 34) 設(shè)計(jì)成 9 種不同的處理。將誘導(dǎo)的芽單獨(dú)切離下來(lái)接種到培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種30個(gè)芽，分別接種在5個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6個(gè)芽，重復(fù) 3 次。30 d 后調(diào)查其增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況。

  1.2.3 生根培養(yǎng)

  以MS為基本培養(yǎng)基，添加IBA，濃度分別設(shè)定為0.1、0.5、1.0 mg/L，切取2.0 cm左右健壯一致的微枝轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，共3個(gè)處理，每個(gè)處理接種50株，重復(fù)3次，25 d調(diào)查生根率、生根條數(shù)。

  1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

  按下列方法統(tǒng)計(jì)污染率、成活率、增殖系數(shù)和生根率，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

  污染率=(外植體污染數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

  褐化率=(外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

  成活率=(外植體誘導(dǎo)成活數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

  增殖系數(shù)=增殖的苗數(shù)/接種苗數(shù)。

  生根率=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 消毒劑、培養(yǎng)基對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響

  不同消毒方式對(duì)外植體滅菌效果有較大影響，選擇適宜的消毒劑及濃度直接影響著能否獲得大量無(wú)菌材料。由表1可見(jiàn)，不同處理間污染率、褐化率和成活率均存在顯著、非常顯著差異。處理1污染率達(dá)到100%，成活率為0;處理3和9雖然無(wú)污染，但是大部分材料褐化、甚至死亡，誘導(dǎo)成活率較低，分別為19.63%和39.15%;處理2、4、8污染率較高，處理5和7褐化率較高;而處理6即用75%乙醇處理30 s、0.1%升汞處理8 min、2%次氯酸鈉處理2 min效果很好，污染率為2.88%，褐化率為15.93%，成活率為81.11%。

  培養(yǎng)基能提供植物組織生長(zhǎng)所必要的養(yǎng)料，選擇適宜的培養(yǎng)基是關(guān)系組培體系成功的關(guān)鍵因素之一。消毒處理后的莖段接種到1/2 MS、MS、WPM培養(yǎng)基上，未褐化的腋芽培養(yǎng)一周開始萌動(dòng)，10 d左右葉片開始展開、節(jié)間伸長(zhǎng)。在MS培養(yǎng)基上，腋芽生長(zhǎng)較快，芽生長(zhǎng)健壯、嫩綠，在1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一般，在WPM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)很慢，因此本研究確定MS為樹莓“波拉納”組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

  表1 消毒劑、培養(yǎng)基類型對(duì)樹莓“Polana” 腋芽萌發(fā)的影響

  注：同一列不同小寫字母表示在P= 0.05水平上差異顯著，同一列不同大寫字母表示在P= 0.01水平上差異非常顯著，下同。

  2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)芽增殖的影響

  將誘導(dǎo)的幼苗接種到不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的MS培養(yǎng)基上，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，各處理間增殖系數(shù)、苗高均存在非常顯著差異。當(dāng)使用NAA與6-BA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合時(shí)，切口處逐漸產(chǎn)生褐化的愈傷組織，培養(yǎng)一段時(shí)間后植株的葉片逐漸變黃，幼苗生長(zhǎng)越來(lái)越差，很終死亡。在培養(yǎng)基中添加KT與NAA、6-BA配合使用，10 d后基本逐漸膨大，30 d能夠誘導(dǎo)出嫩綠的叢生芽，說(shuō)明KT對(duì)“波拉納”叢生芽的誘導(dǎo)有重要作用。當(dāng)使用1.0 mg/LKT與NAA、6-BA組合時(shí)，叢生芽的分化能力較強(qiáng)，當(dāng)使用2.0 mg/LKT與NAA與6-BA組合時(shí)，叢生芽分化數(shù)量有所減少。9個(gè)處理中增殖系數(shù)很高的是處理4，與處理7、8、9達(dá)到非常顯著差異，苗高很高的是處理4，與處理5、9達(dá)到非常顯著差異。從增殖系數(shù)和苗高進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)選出，叢生芽增殖的很佳培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為: MS + KT1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ 6-BA0.5 mg/L，增殖系數(shù)為5.14，苗高為2.89 cm。

  表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)樹莓 “Polana” 叢生芽增殖的影響

  2.3 生根培養(yǎng)

  切取2 cm高，且生長(zhǎng)一致健壯的微枝，分別接種到添加不同濃度IBA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，不同處理間生根率、生根條數(shù)達(dá)到非常顯著、顯著差異(表3)，當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L時(shí)，生根時(shí)間較晚，15 d左右生根，25 d時(shí)生根率較低，為86.15%，生根條數(shù)為5.25條;當(dāng)IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)，一周后開始生根，25 d生根率達(dá)到100%，生根條數(shù)達(dá)到6.14條，主根粗壯。當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)，試管苗也是一周左右開始生根，生根率均達(dá)到100%，生根率與生根條數(shù)與IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)差異不顯著，但是主根細(xì)長(zhǎng)。

  表3 IBA濃度對(duì)樹莓“Polana”生根的影響

  3 結(jié)論與討論

  對(duì)外植體進(jìn)行滅菌處理是建立組織培養(yǎng)體系的第一個(gè)環(huán)節(jié)，消毒劑和消毒時(shí)間決定著滅菌效果的好壞。消毒處理時(shí)間太短則滅菌效果差，外植體會(huì)因染菌而逐漸死亡;消毒處理時(shí)間太長(zhǎng)，消毒劑會(huì)導(dǎo)致外植體褐化，甚至直接死亡。針對(duì)樹莓品種“波拉納”，本試驗(yàn)篩選出很佳消毒處理方案為：75%乙醇處理30 s+0.1%升汞處理8 min+2%次氯酸鈉處理2 min效果很好。

  以往有關(guān)樹莓組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，主要研究了不同品種、不同外植體、培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)和生根的影響。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因子之一，且不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)樹莓離體材料的誘導(dǎo)及叢生芽分化有顯著差異。NAA、6-BA、ZT、KT和 TDZ是誘導(dǎo)樹莓外植體分化中常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，而適宜濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的添加對(duì)于不同外植體的分化起決定性作用。研究表明，在“圖拉明”(Tulameen)叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程中，添加0.1 mg/LTDZ與1.0 mg/L BA配合可獲得很佳的繁殖效果，但TDZ與IAA配合對(duì)“圖拉明”生根并沒(méi)有促進(jìn)作用。李海燕等(2011)研究表明，6-BA有利于樹莓品種“金克維”(Kivigold)叢生芽的繼代增殖，但6-BA的濃度應(yīng)該低于1.5 mg/L。本研究以MS培養(yǎng)基附加不同濃度的KT、NAA和6-BA進(jìn)行“波拉納”叢生芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明KT在叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在不含KT的培養(yǎng)基上，幼苗不分化，長(zhǎng)勢(shì)差逐漸褐化死亡。當(dāng)使用1.0 mg/LKT時(shí)，叢生芽分化能力明顯比使用2.0 mg/LKT與NAA與6-BA組合時(shí)強(qiáng)，這說(shuō)明高濃度KT對(duì)叢生芽誘導(dǎo)有抑制作用。叢生芽很佳增殖的培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為:MS + KT1.0 mg/·L+ NAA 0.1 mg/L+6-BA0.5 mg/L。

  在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，IBA被廣泛用于試管苗的生根研究。在“波拉納”的生根實(shí)驗(yàn)中，IBA濃度對(duì)生根影響較大，在0.1～1.0 mg/L范圍內(nèi)，隨著IBA濃度升高，生根率也隨之升高，但并不是隨著IBA濃度越大，生根情況越好，IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)，根細(xì)長(zhǎng)，狀態(tài)不好。因此，很適宜“波拉納”生根的培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度為MS+IBA0.5 mg/L。