1、外圍準(zhǔn)備

  碟子和所有器械清洗完畢后將水擦干，用報(bào)紙捆包好，再放滅菌鍋內(nèi)滅菌。需滅菌的器械有：鑷子、剪刀、解剖刀，碟子(8個(gè)包一包)，玻璃杯2個(gè)和紗布(紗布用手撕成小塊，不能用剪刀剪，否則用于擦試工作臺(tái)等容易留下剪刀口布屑)。

  培養(yǎng)基可不經(jīng)過煮制，將所有物質(zhì)稱量好，瓊脂粉等需要溶解的物質(zhì)溶解，之后混合定容調(diào)pH值，再倒入灌裝機(jī)分裝，分裝時(shí)需不停的攪拌培養(yǎng)基，灌裝時(shí)勿將培養(yǎng)基滴灑在瓶口，否則需用抹布擦干凈或換玻璃瓶。

  滅菌鍋在消毒前先預(yù)熱，將夾層壓力上升，減少煮制時(shí)間，煮完后手動(dòng)慢慢放氣(使?jié)駸嵴羝脽嵘⑷ザ淮驖穹莱蔽?讓壓力下降，10min左右讓室內(nèi)壓力降至0(避免悶鍋時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝固)，后取出后趁熱迅速擰緊瓶蓋，待冷卻后移至緩沖室平放，使培養(yǎng)基平鋪在瓶底凝固。

  外植體取材：取當(dāng)年生萌動(dòng)狀態(tài)的飽滿嫩枝芽作為外植體，先用5%洗衣粉浸泡5min，用刷子輕輕刷，用流水沖洗，時(shí)間視材料清潔程度而定，蒸餾水沖洗3~5次，可去除較多泥塵和微生物，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)~吐溫，之后將外植體切割成適當(dāng)大小，滅菌容器能放入為宜，移至酒精擦試好的帶蓋無菌瓶子內(nèi)，放入無菌操作臺(tái)備用。

  2、內(nèi)圍接瓶

  將所有需要擺上無菌操作臺(tái)的東西用酒精擦試表面后擺好，需用酒精擦試的物品(包括：工作臺(tái)面，臺(tái)周圍玻璃和母瓶，新培養(yǎng)基瓶，酒精燈，擱置架，打火機(jī)等)，母瓶和新培養(yǎng)基放左上方，酒精燈放左下方，身體正前方放碟子，右上方靠左放器械擱置架，右上方靠右放接種器械滅菌器，左下方放打火機(jī)和半瓶70%酒精，后開紫外燈20min，再通風(fēng)20min后開始操作。

  工作人員進(jìn)入無菌接種室前，應(yīng)先將手表、手鐲、戒子等放室外，將手和手腕用肥皂清洗干凈后，用酒精紗布擦拭雙手、雙腕，之后換工作服，包括更換拖鞋，穿白大褂，接種人員還要扎好頭發(fā)，戴好帽子和口罩，指甲需剪短，將手和手臂用酒精擦試后戴手套操作，在組培室內(nèi)不得高聲喧嘩、打鬧，接種時(shí)不得隨意談話、說笑，以免造成污染，臺(tái)外人員走動(dòng)要輕，動(dòng)作要小。

  打開無菌操作臺(tái)玻璃門之前先用酒精霧噴，使懸浮在無菌操作臺(tái)周圍的灰塵顆粒沉降，操作時(shí)將擱置架在酒精火焰上方灼燒一下，打開包裝好的碟子(注意手一定不能接觸碟子邊沿)，鑷子、解剖刀從報(bào)紙取出后，先用酒精擦試一下，再放在酒精燈火焰上灼烤1遍(工具的每1點(diǎn)在火焰上灼烤時(shí)間不得少于5s)，之后開始接(轉(zhuǎn))苗。外植體的消毒用酒精和次氯酸鈉(鈣)，最優(yōu)消毒為：既有污染的，也有消毒好沒被污染的，也有褐化的。

  取苗：瓶子在打開之前瓶口都需在火焰上灼燒7~10s，正式取苗時(shí)，瓶口不要斜向外或直立向上，以免空氣中微生物落入瓶中。轉(zhuǎn)苗時(shí)一次取苗不可太多，以免風(fēng)干。切苗：碟子放在離風(fēng)窗10~20cm處，鑷子和手術(shù)刀不可太熱，在操作過程中，手要在碟子斜上方操作，不可在其正上方操作，更不能交叉過碟子上方操作，切苗過程中產(chǎn)生的垃圾堆放在碟子一側(cè)。注意操作操作人員的頭、胳膊等不得進(jìn)入臺(tái)內(nèi)。接苗：將未接瓶的培養(yǎng)基瓶口在酒精燈火焰上灼烤7~10s，烤完瓶口后再接苗，接苗時(shí)，鑷子不要與瓶口接觸，一瓶?jī)?nèi)一般接5~6棵苗，動(dòng)作迅速，組培苗在瓶?jī)?nèi)排放均勻整齊，美觀。

  封口、記錄，接好后用酒精火焰灼燒瓶口封口，后迅速蓋好瓶蓋扭緊。碟子1瓶母瓶用1個(gè)，用完之后用鑷子挑起拿開，接好的瓶苗隨手放到無菌操作臺(tái)外面推車上，工作過程中所產(chǎn)生的垃圾及時(shí)清理，防止交叉污染。下臺(tái)前把品種代號(hào)、培養(yǎng)基類型、個(gè)人編號(hào)以及接種日期標(biāo)示到瓶上。接好后將工作臺(tái)擦試干凈，把接種過程中產(chǎn)生的垃圾清理掉，臺(tái)上的物品擺放整齊，用消毒粉兌水拖接種室和培養(yǎng)室地面，后開紫外燈照射。工作人員進(jìn)出組培室隨手關(guān)門。培養(yǎng)室需密閉，避免蟲子進(jìn)入，室溫控制在25℃左右，保證植物培養(yǎng)最適溫度。

  3、滅菌

  一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就隨即滅菌處理，大量的進(jìn)行高壓鍋滅菌，少量的加入工業(yè)酒精在室外進(jìn)行處理。室內(nèi)空氣滅菌：每四周用高猛酸鉀和甲醛(或臭氧)對(duì)室內(nèi)空氣滅菌1次。室內(nèi)地面：每接種1次用消毒粉兌水拖一遍地面。

  通過組織培養(yǎng)試驗(yàn)技術(shù)的研究，為日后本所香芋、馬蹄的組織培養(yǎng)提供參考數(shù)據(jù)和技術(shù)支持，為樂昌農(nóng)民提供高質(zhì)量香芋、馬蹄種苗，使農(nóng)民獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。