本研究通過(guò)組織培養(yǎng)，對(duì)葉下珠進(jìn)行芽的誘導(dǎo)、增殖、生根和煉苗移栽等，建立了一套完整的葉下珠組培快繁體系，為葉下珠大規(guī)模繁殖提供技術(shù)參考。

葉下珠組培方法

1、培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為 MS，瓊脂 7.5 g·L-1，蔗糖為 30 g·L-1，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)溫度(25 ± 1) ℃，光照時(shí)間12 h·d -1，光照強(qiáng)度1000～1500 lx。

2、外植體接種

選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的葉下珠植株，用剪刀剪取位于植株中部的莖段，去除葉片與假葉柄。加1～2滴洗潔精將莖段表面洗刷干凈，流水沖洗5～6 h。于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，然后用0.1%升汞消毒13 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，并用無(wú)菌濾紙擦干，置于接種盤(pán)上。用手術(shù)刀將外植體切成1.5～2 cm帶節(jié)莖段，生物學(xué)頂端朝上接種于培養(yǎng)基上。

3、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比試驗(yàn)

將消毒外植體接種到按單因素多水平設(shè)計(jì)的不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的、添加0.5 g·L-1活性炭的MS培養(yǎng)基中，共計(jì)7組，分別為：IBA為0.2 mg·L-1，6-BA分別為1.0、1.5、2.0、3.0 mg·L-1;6-BA 為 1.5 mg·L-1，IBA 分別為 0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1 。每組 15 瓶，每瓶接 1個(gè)外植體，每3 d觀察1次，15 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。

4、誘導(dǎo)培養(yǎng)基 得出芽誘導(dǎo)佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方后，對(duì)比添加0.5 g·L-1活性炭的MS和1/2MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，共2組，每組24瓶，每瓶接1個(gè)外植體，每4 d觀察1次，20 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。

5、不同濃度6-BA對(duì)葉下珠芽的處理

將莖段誘導(dǎo)出的芽在超凈工作臺(tái)上切成1.5～2 cm帶芽莖段，接種至添加不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中，共計(jì)3組，每處理5瓶，每瓶2個(gè)，即每處理10個(gè)外植體，每5 d觀察1次，25 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖情況。

6、不同濃度NAA與IBA對(duì)叢生芽的處理

將增殖擴(kuò)繁的叢生芽在超凈工作臺(tái)上分成單個(gè)芽，接種至添加蔗糖20 g·L-1的不同培養(yǎng)基中，共計(jì)6組，每處理5瓶，每瓶10個(gè)芽，即每處理50個(gè)芽，每5 d觀察1次，25 d后統(tǒng)計(jì)生根、長(zhǎng)勢(shì)情況。

7、煉苗

將生根的瓶苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室外進(jìn)行煉苗，處理時(shí)間設(shè)置見(jiàn)表5。煉苗后清水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至加水拌成泥狀的菜園土基質(zhì)。栽培條件：自然光，氣溫25～30 ℃。移栽15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

葉下珠的主要藥理活性成分柯里拉京是一種多酚類(lèi)物質(zhì)，極容易氧化。在外植體誘導(dǎo)叢生芽的過(guò)程中，莖節(jié)的切口會(huì)分泌大量次生代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致外植體褐化，降低組培成功率。外植體褐化程度高，需通過(guò)多次轉(zhuǎn)接以避免褐化，但是多次轉(zhuǎn)接易造成污染。本試驗(yàn)通過(guò)添加活性炭以吸收次生代謝物，抑制褐化效果良好，也減少人為操作帶來(lái)的污染。

在芽增殖試驗(yàn)中，1.0 mg·L-1 6-BA 和0.2 mg·L-1 IBA的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合是較適合芽增殖的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，但他們認(rèn)為芽增殖中6-BA佳濃度為2.0 mg·L-1。本研究中6-BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg·L-1的芽增殖系數(shù)均達(dá)3倍以上，并以1.0 mg·L-1時(shí)增殖倍數(shù)大，小芽長(zhǎng)勢(shì)好。

在煉苗移栽研究中，基質(zhì)為泥狀菜園土。泥狀土在栽培初期水分飽滿(mǎn)，但后期易結(jié)塊，對(duì)組培苗成活率造成一定影響?？蛇m當(dāng)添加一定比例的有機(jī)土進(jìn)行改良，調(diào)整土壤疏松度，以利于移栽苗成活。