【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)別名鐵皮蘭、黑節(jié)草，屬蘭科石斛屬多年生附生草本植物，被譽(yù)為藥材之上品。祖?zhèn)麽t(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，鐵皮石斛具有健脾養(yǎng)胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效;用于治療慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等;長(zhǎng)期服用具美容、抗衰老和延年益壽之功效(蔡光先等，2011)。由于鐵皮石斛的重要藥用價(jià)值和保健作用，近幾十年來(lái)人們對(duì)野生鐵皮石斛的需求量急劇增加，導(dǎo)致人們掠奪式采集，其資源日趨減少，已被列入植物保護(hù)紅皮書(傅立國(guó)和金鑒明，1992)。鐵皮石斛人工快繁不僅可以擺脫人們單純依靠采集野生鐵皮石斛的狀態(tài)，還對(duì)森林生態(tài)條件和生物多樣性保護(hù)及鐵皮石斛資源持續(xù)開發(fā)利用均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)70年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行組織培養(yǎng)和快速繁殖研究。王碧琴和蓋安俊(2006)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的外植體在MS+6-BA 0.5～2.0 mg/L+ NAA 0.25～0.4 mg/L或2，4-D 0.25 mg/L培養(yǎng)基中能誘導(dǎo)分化叢生芽3～5倍;原球莖分化叢生芽10～15倍;壯苗后在1/2MS+NAA 0.2～0.5 mg/L中誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)90%以上。Huang等(2011)探討鐵皮石斛種子萌發(fā)、芽增殖和生根的適宜培養(yǎng)基，認(rèn)為經(jīng)馬鈴薯泥、香蕉泥培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗，生長(zhǎng)健壯，能為生產(chǎn)提供大量的種苗。此外，鐵皮石斛不定芽的生根培養(yǎng)基主要有N6+NAA 2.5 mg/L+10%土豆汁(袁正仿等，2002)、1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC(朱艷和秦民堅(jiān)，2003)、MS+NAA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L(單芹麗等，2010)等。【本研究切入點(diǎn)】目前，鐵皮石斛試管苗快繁的培養(yǎng)基配方已很成熟，影響組培快繁技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的瓶頸是試管苗的大田移栽(溫明霞等，2007)，培養(yǎng)健壯，尤其是生根多、根長(zhǎng)的試管苗是提高移栽成活率的根本措施?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用正交試驗(yàn)考察光照強(qiáng)度、pH和瓊脂用量對(duì)鐵皮石斛叢生苗生根效果的影響，克服單因素試驗(yàn)研究的不足，優(yōu)化其生根培養(yǎng)條件，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中優(yōu)良種苗的供應(yīng)提供技術(shù)支持。

  1 材料與方法

  1.1 試驗(yàn)材料

  鐵皮石斛于2010年6月采自云南省昆明地區(qū)，部分植株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)出原球莖保存于三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院組織培養(yǎng)研究室。增殖過(guò)程中部分原球莖分化出叢生芽，挑選1 cm以上的叢生小苗進(jìn)行生根試驗(yàn)。

  1.2 試驗(yàn)方法

  1.2.1 培養(yǎng)基選擇 選擇1/2MS+10%香蕉汁+NAA(1.0～3.0 mg/L)+6-BA(0～0.5 mg/L)+0.5%AC+7.5 g/L瓊脂作為鐵皮石斛的壯苗生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度25℃，濕度50%～60%，光照強(qiáng)度1500 lx，每天光照12 h，pH 5.5。根據(jù)激素配比設(shè)6個(gè)處理，每處理接種15瓶，每瓶6株，重復(fù)3次。60 d后統(tǒng)計(jì)小苗鮮重和生根苗數(shù)，計(jì)算生根率。

  生根率(%)=生根苗數(shù)/總苗數(shù)×100

  1.2.2 培養(yǎng)條件篩選 在選擇培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)光照強(qiáng)度、pH和瓊脂用量3因素選取3水平形成9個(gè)處理對(duì)鐵皮石斛生根條件進(jìn)行研究(表1)，每處理接種15瓶，每瓶6株，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)室濕度50%～60%，每天光照12 h。

  表1 鐵皮石斛生根的試驗(yàn)因素及水平

  Tab.1 Experimental factors and levels ofDendrobium officinalerooting in vitro

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 定期觀察記錄試管苗的長(zhǎng)勢(shì)情況，使用SPSS 17.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 不同激素處理對(duì)試管苗壯苗生根的影響

  從表2可知，接種60 d后，隨著MS培養(yǎng)基中NAA濃度的升高，試管苗的鮮重和生根率呈逐漸降低的趨勢(shì)，不同處理間試管苗的鮮重和生根率差異明顯;其中，MS培養(yǎng)基中添加NAA 1.0 mg/L(處理1)和NAA 2.0 mg/L(處理3)的試管苗長(zhǎng)勢(shì)好，表現(xiàn)出生長(zhǎng)迅速、葉片肥厚、莖粗壯、根系發(fā)達(dá)等優(yōu)勢(shì)，試管苗的平均鮮重和生根率高，與其他處理間差異顯著。在添加NAA 1.0～3.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L組合的MS培養(yǎng)基中，隨著NAA濃度的升高，試管苗的鮮重和生根率不斷顯著提高，但均低于僅添加NAA的處理。

  表2 不同激素處理對(duì)試管苗的影響

  Tab.2 The impact of different hormone treatments of plantlets

同列不同小寫字母表示在5%水平上的差異顯著性

  Different lowercase letters in the same column represent the significant difference at 5%level

  2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)試管苗生根的影響

  試管苗在接種13 d后，葉片變綠，開始長(zhǎng)出白色纖細(xì)根須。接種30 d后，葉片濃綠，莖伸長(zhǎng)2～3倍，節(jié)間明顯，根增長(zhǎng)變粗，附有根毛。接種60 d后，大部分植株生長(zhǎng)健壯，有的莖葉甚至頂?shù)脚囵B(yǎng)瓶瓶塞;不同處理的生根數(shù)為1～8條，根長(zhǎng)0.5～5.0 cm，以處理5、7、9的根多、長(zhǎng)，處理1、2、3的根生長(zhǎng)緩慢(表3)。此外，部分鐵皮石斛試管叢生苗在接種生根培養(yǎng)基時(shí)已出現(xiàn)1～2條短根，這些叢生苗生長(zhǎng)速度較快。

  表3 鐵皮石斛正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  Tab.3 Orthogonal test results ofDendrobium officinale

T代表生根數(shù)均值，X代表根長(zhǎng)均值，R代表極差

  “T”represents average rooting number，“X”represents average root length，“R”represents range

  2.3 極差分析與方差分析

  從表3可知，影響生根數(shù)的3因素主次順序?yàn)锳>C>B，優(yōu)水平組合為A3B2C3;影響根長(zhǎng)的3因素主次順序A>C>B，優(yōu)水平組合為A3B1C3?？梢?，A因素(光照強(qiáng)度)對(duì)鐵皮石斛試管苗生根的影響大，其次是C因素(瓊脂用量)的影響，B因素(pH值)的影響弱。試管苗生根越多越易存活，從平均生根數(shù)上考慮，生根培養(yǎng)基的3因素優(yōu)水平組合為A3B2C3。

  表3中3因素的極差分析結(jié)果都大于誤差項(xiàng)(空列)，說(shuō)明它們對(duì)試管苗根的生長(zhǎng)都有不同程度的影響，需采用方差分析進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)試管苗平均生根數(shù)進(jìn)行方差分析，從表4可以看出，A因素(光照強(qiáng)度)和C因素(瓊脂用量)對(duì)試管苗生根數(shù)的影響較大，二者分別達(dá)極顯著水平和顯著水平，B因素(pH值)對(duì)鐵皮石斛試管苗生根數(shù)的影響較小。對(duì)試管苗平均根長(zhǎng)進(jìn)行方差分析，從表5可知，A因素(光照強(qiáng)度)和C因素(瓊脂用量)對(duì)試管苗根長(zhǎng)的影響較大，二者均達(dá)顯著水平，B因素(pH值)對(duì)鐵皮石斛試管苗根長(zhǎng)的影響較小。綜上所述，極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果高度一致。

  3 討論

  近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)鐵皮石斛人工快繁進(jìn)行了大量研究，并在培養(yǎng)基選擇及其成分配比方面取得很大進(jìn)展。本研究選用鐵皮石斛生根主流培養(yǎng)基，通過(guò)優(yōu)化激素配比，并在此基礎(chǔ)上研究光照強(qiáng)度、pH和瓊脂用量3因素對(duì)生根效果的影響，從而確定試管苗的佳生根條件。在含10%香蕉汁的MS培養(yǎng)基中添加低濃度NAA時(shí)，有利于鐵皮石斛試管苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)及根系發(fā)生，而添加6-BA和高濃度的NAA具有一定的抑制作用。在生產(chǎn)上，向培養(yǎng)基中添加1.0～2.0 mg/L NAA用于生根培養(yǎng)為適宜。在選擇適宜的生根培養(yǎng)基后，光照強(qiáng)度和瓊脂用量對(duì)鐵皮石斛試管苗生根的數(shù)量和長(zhǎng)度有顯著影響，而pH值的影響不顯著。適宜的酸性條件加快了根的形成和植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，達(dá)到生根壯苗的目的，本研究設(shè)定的酸性范圍(5.0～6.0)對(duì)根生長(zhǎng)沒有顯著差異，但酸度太低或太高都不利于植株生長(zhǎng)(陳青青等，2010)，而且10%香蕉泥添加物對(duì)維持培養(yǎng)基pH起一定緩沖作用。在研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在較強(qiáng)光照培養(yǎng)條件下的試管苗根多且長(zhǎng)，有利于試管苗移栽成活率的提高，說(shuō)明光照強(qiáng)度大小是培養(yǎng)鐵皮石斛試管苗的關(guān)鍵因素之一。瓊脂的用量影響固體培養(yǎng)基的軟硬程度，本研究結(jié)果表明，較硬的培養(yǎng)基促進(jìn)了根的發(fā)生和生長(zhǎng)，這可能與鐵皮石斛喜歡附生的自然特性有關(guān)。

  表4 平均生根數(shù)方差分析結(jié)果

  Tab.4 The variance analysis of average rooting number

表5 平均根長(zhǎng)方差分析結(jié)果

  Tab.5 The variance analysis of average root length

4 結(jié)論

  鐵皮石斛試管苗適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+ 10%香蕉泥+NAA 1.0 mg/L+2%蔗糖+0.05%AC，試管苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá);適宜的生根條件為光照強(qiáng)度2000 lx、瓊脂用量8 g/L、pH 5.5。

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